Редактирование гена CRISPR-Cas9

Обзор

CRISPR-Cas9 — это платформа редактирования генома, адаптированная на основе систем защиты бактерий. Гидовая РНК направляет нуклеазу Cas9 к комплементарной последовательности ДНК, расположенной рядом с коротким мотивом узнавания, что позволяет исследователям осуществить целенаправленный двухцепочечный разрыв.

Технические основы

Cas9 представляет собой РНК-ориентированную эндонуклеазу, чьи каталитические домены HNH и RuvC расщепляют противоположные цепи ДНК. Распознавание мишени начинается с мотива, примыкающего к протоспейсеру, или PAM, и продолжается через образование R-петли РНК-ДНК. Комплементарность в PAM-проксимальной затравочной области направляющей особенно важна, хотя допустимые несовпадения зависят от последовательности и контекста хроматина. Результирующий двухцепочечный разрыв обрабатывается в основном за счет негомологичного соединения концов, микрогомологического соединения концов или гомологии-направленной репарации, что приводит к распределению аллелей, а не к одному гарантированному результату последовательности.

Как это работает

После того, как Cas9 разрезает ДНК, клетка восстанавливает разрыв. Соединение концов может привести к появлению небольших вставок или делеций, которые разрушают ген, тогда как репарация, направленная на матрицу, может установить заданную последовательность, когда доступны соответствующая донорская матрица и клеточные условия. Новые редакторы оснований и праймеров модифицируют ДНК, не полагаясь на тот же тип двухцепочечного разрыва.

Методы измерения и исследования

Эксперименты по редактированию количественно оцениваются с помощью секвенирования ампликонов, длинного секвенирования, цифровой ПЦР и, при необходимости, полногеномных анализов на нецелевое расщепление или структурные вариации. Контрольные образцы включают неотредактированный образец, контрольные образцы, предназначенные только для доставки, и ортогональные шаблоны, нацеленные на один и тот же локус. При разработке руководства учитываются прогнозируемая специфичность, заселенность нуклеосом, изоформы транскриптов и варианты популяции, которые могут создавать или удалять мишень. Для доставки можно использовать рибонуклеопротеиновые комплексы, вирусные векторы, липидные наночастицы или электропорацию; каждый метод меняет время воздействия, охват тканей, иммунную активацию и вероятность стойкой нуклеазной активности.

Основные идеи

• Выбор мишени в значительной степени кодируется последовательностью направляющей РНК.
• Результат редактирования зависит как от редактора, так и от путей восстановления клетки.
• Доставка, специфичность и тканевый контекст являются центральными частями экспериментального дизайна.

Текущий рубеж исследований

Технические возможности выходят за рамки разрывов, вызванных нуклеазой. Редакторы оснований цитозина и аденина выполняют выбранные переходы, в то время как прайм-редакторы используют шаблон обратной транскрипции, закодированный в расширенной направляющей РНК, для записи небольших замен, вставок или делеций. Исследователи совершенствуют компактные нуклеазы, тканеселективную доставку и временную экспрессию, чтобы уменьшить непредвиденные эффекты. Основные нерешенные проблемы включают редактирование покоящихся клеток, обнаружение редких хромосомных перестроек, прогнозирование результатов восстановления различных типов клеток и установление клинически значимого долгосрочного наблюдения. Применение зародышевой линии дополнительно требует этического и управленческого анализа, который невозможно решить только с помощью молекулярной точности.

Почему это важно

Эта технология ускоряет функциональную геномику, исследования сельскохозяйственных культур, моделирование заболеваний и разработку некоторых видов генной и клеточной терапии. Его программируемость сделала целевые манипуляции с геномом доступными для многих лабораторий.

Ограничения и открытые вопросы

Нецелевые изменения, неполное редактирование, мозаичные результаты и ограничения доставки могут снизить производительность. Редактирование наследственного генома человека также поднимает серьезные этические и управленческие вопросы, которые отличаются от соматических методов лечения.