Sequência de RNA em uma única célula

Visão geral

Sequenciamento de RNA unicelular separa um tecido em células ou núcleos individuais e registra o perfil amostrado das moléculas do ARN a partir cada uma. Ao contrário do sequenciamento em massa, que é a média de muitas células o método pode revelar populações raras e trajetórias contínua-desenvolvimentais.

Fundações técnicas

A contagem observada para um gene em uma célula é de amostra estocástica moldada por abundância transcrita, eficiência da captura e transcrição reversa. Identificadores moleculares únicos reduzem o viés de amplificação por meio do colapso das leituras derivada da molécula capturada. Plataformas de gota escalam para muitas células, mas amostra apenas uma fração dos transcritoes. O sequenciamento de um único nucleo evita a dissociação tecidual difícil e pode recuperar material arquivado ou congelado, mas composição nuclear do ARN difere sistemáticamente das medições inteiras da célula.

Como funciona

As células são isoladas em poços, gotícula ou câmaras microfluídica. Durante a transcrição reversa, transcritos recebem um código de barras celular e geralmente identificador molecular único. Após a preparação e sequenciamento de bibliotecas agrupadas, as leituras são atribuídas às células ou genes produzindo uma matriz da contagem esparsa filtrada .

Métodos de medição e pesquisa

Fluxos de trabalho computacionais removem códigos em barras com baixa qualidade usando tamanho da biblioteca, características detectada e proporção mitocondrial; identificamos dublês ou estimaremos a contaminação ambiente-RNA. Normalização e modelagem de variância precedem a redução da dimensionalidade, construção do gráfico vizinho-e agrupamento. Os testes de expressão diferencial devem tratar replicações biológicas, em vez das milhares da células a partir do espécime como as unidades independentes quando se pretende inferência populacional. A integração de lotes pode alinhar a biologia compartilhada, mas podem apagar estados reais específicos da condição. A anotação baseada em marcadores é reforçada por mapeamento de referência, ensaios espaciais e citometria do fluxo.

Ideias-chave

• Um zero medido pode representar ausência biológica ou falha na captura de uma transcrição.
• A dissociação celular, o RNA ambiente e os dublês podem criar artefatos sistemático antes do início da sequenciamento.
• Os tipos de células são inferidos a partir dos múltiplos marcadores, contexto experimental e validação independente em vez da etiqueta do agrupamento.

Fronteira actual da investigação

A fronteira combina transcriptomas com acessibilidade à cromatina, proteínas de superfície e códigos-de­bar da linhagem. Os métodos de trajetória e velocidade do RNA estimam a direção dinâmica dos dados instantâneos sob pressupostos sobre cinética ou amostragem; eles não observavam diretamente uma linhagem. Grandes atlas requerem modelos hierárquicos que preservam variação e incerteza doador. A análise do conhecimento de privacidade é importante, pois variantes genéticase expressas podem identificar participantes. Os desafios restantes incluem calibração absoluta da molécula, recuperação de células raras e alinhamento entre estudos ontologias. Modelo mecanicistas que distinguem uma transição regulatória das mudanças correlacionadas no ciclo celular ou do processamento tecidual

Por que importa

A tecnologia mapeia o desenvolvimento, a imunidade e as organizações de câncer em resolução celular. Ele suporta atlases de doença, descoberta alvo e experimentos que conectam perturbações com mudanças no estado celular.

Limites e questões em aberto

A abundância de RNA é apenas uma camada do estado celular e não mede diretamente a atividade proteica, posição espacial ou história da linhagem. Custo, viés amostral e efeitos de lote.