Single-Cell RNA Sequencing

Genel Bakış

Tek hücre RNA, bir doku bireysel hücrelere veya nüklegelere ayırıyor ve her birinden RNA molekülleri örnekleyici bir profil kaydeder. Birçok hücre üzerinde ortalamaların bulunduğu toplu sequencing aksine, yöntem nadir popülasyonları ortaya çıkarabilir, geleneksel anatomik bir etiket paylaşan hücreler arasındaki geçici yanıtlar ve farklılıklar.

Teknik temeller

Bir hücredeki bir gen için gözlemlenen sayı, transkript miktarı ile şekillendirilen bir stochastic örnektir, yakalama verimliliği, ters transkripsiyon, amplifikasyon ve sequencing derinliktir. Benzersiz moleküler tanımlayıcılar, yakalanan bir molekülden elde edilen okurların kıvrımını azaltmaktadır. Droplet platformları birçok hücreye ölçeklenir, ancak sadece transkriptlerin bir kısmını örnekle, plaka tabanlı protokollerin daha düşük transkriptlerde daha fazla hassasiyet elde edebilir. Tek çekirdekli, zor doku dissocitasyondan kaçınır ve arşivlenmiş veya donmuş materyali geri alabilir, ancak nükleer RNA kompozisyonu tüm hücre ölçümlerinden sistematik olarak farklıdır ve protokol-aware yorum gerektirir.

Nasıl çalışır

Hücreler iyi, damlacık veya mikrofluidic odalarda izole edilir. Ters transkript sırasında, transkriptler bir hücre barkodu alır ve genellikle eşsiz bir moleküler tanımlayıcı alır. Kütüphane hazırlığı ve ayrımı aldıktan sonra, okurlar ve genlere geri verilir, filtrelenmiş, normalleştirilmiş ve analiz edilen bir sparse say matrix üretir.

Ölçme ve Araştırma Yöntemleri

C. iş akışları kütüphane boyutunu kullanarak düşük kaliteli barkodları ortadan kaldırır, tespit edilen özellikler ve Concordl oranını tanımlar, çiftleri tanımlar ve çevre-RNA kirliliğini tahmin eder. Normalleşme ve değişkenlik modelleme önceki boyutsal azalma, komşu-graf inşaatı ve kümeleme. Diferansiyel ifade testleri, bir örnekten binlerce hücreden ziyade biyolojik çoğaltmaları tedavi etmelidir, çünkü nüfus inferencesi amaçlandığında bağımsız birimler olarak. Batch entegrasyonu, paylaşılan biyolojiyi uyumlu olabilir ancak gerçek koşula özel devletleri silebilir. Marker tabanlı annotasyon referans haritalama, uzaysal assays, akış cytometri, perturbasyon deneyleri veya lineage bilgileri tarafından güçlendirilir.

Anahtar fikirler

• Ölçülen bir sıfır, bir transkript yakalamak için biyolojik yokluğu veya başarısızlığı temsil edebilir.
• Hücre dissociation, ortam RNA ve çiftts, sequencing başlamadan önce sistematik bir sanat yaratabiliyor.
• Hücre türleri birden çok işaretleyiciden, deneysel bağlamdan ve bağımsız geçerlilikten tek bir küme etiketinden ziyade ertelenmektedir.

Mevcut araştırma sınırları

Sınır, transkriptoları chromatin erişilebilirliği, yüzey proteinleri, lineage barkodları, perturbasyonları ve uzaysal koordinatları aynı veya eşleştirilmiş hücrelerle birleştirir. Trajektör ve RNA-velocity yöntemleri, kinetics ve örnekleme ile ilgili varsayımlar altında anlık verilerden dinamik bir yön tahmin eder; doğrudan bir çizgi gözlemlemezler. Büyük atlas, donör varyasyonu ve belirsizliği koruyan hiyerarşik modeller gerektirir. Gizlilik-aware analizi önemlidir, çünkü genetik varyantlar katılımcıları tanımlayabilir. Kalan zorluklar, hücre döngüsünde korelasyon, nadir-tel kurtarma, çapraz-study ontology hizalama ve mekaniksel modeller içerir, hücre döngüsünde korelasyonlardan, stres veya doku işlemesinde düzenleyici bir geçiş ayırt eder.

Neden önemli?

Teknoloji haritaları gelişim, bağışıklık, kanser ve doku organizasyonu hücresel kararda. Hastalıkları, hedef keşif ve deneyleri hücre devlet değişiklikleri ile perturbasyonları birleştiren destekler.

Limitler ve açık sorular

RNA bolluğu sadece hücre devletinin bir katmanıdır ve doğrudan protein aktivitesini, uzaysal pozisyonu veya lineage tarihini ölçmemektedir. Maliyet, örnekleme önyargı, pan etkiler ve donör-linked genomic bilgi kısıtlı çalışma tasarımı ve yorumlanması.