Одноклеточное РНК-секвенирование

Обзор

Одноклеточное РНК-секвенирование разделяет ткань на отдельные клетки или ядра и записывает отобранный профиль молекулРНА из каждой. В отличие от объемного секвенирования, которое в среднем происходит по многим клеткам и может выявить редкие популяции клеток; непрерывные траектории развития (trajectories), переходные реакции или различия между клетками.

Технические основы

Наблюдаемое количество гена в клетке представляет собой стохастический образец, сформированный изобилием транскриптов . эффективность захваты; обратная стенокардия и глубину секвенирования Уникальные молекулярные идентификаторы уменьшают смещенность амплификации, разрушая показания производные от одной захваченной молекулы. Платформы Droplet масштабируются до многих клеток, но берут пробу только части транскриптов; в то время как протокол на основе пластин может достигать большей чувствительности при более низкой пропускной способности. Одноядерное секвенирование позволяет избежать сложной диссоциации тканей и может восстановить архивированный или замороженный материал, но состав ядерной РНК систематически отличается от измерений целых клеток.

Как это работает

Клетки изолированы в колодцах, каплями или микрофлюидных камерах. Во время обратной транскрипции, стенограммы получают клеточный штрих-код и обычно уникальный молекулярные идентификатор. После объединенной подготовки и секвенирования библиотеки, показания назначаются обратно клеткам или генам для получения матрицы разреженного счета (spared count matrix), которая фильтруется статистически.

Методы измерения и исследования

Вычислительные рабочие процессы удаляют некачественные штрих-коды с использованием размера библиотеки, обнаруженных функций и митохондрии пропорции; выявляют дублетов (двойников) или оценивают загрязнение окружающей среды РНК. Нормализация и моделирование дисперсий предшествуют уменьшению размерности, построение соседнего графа. Дифференциальные экспрессионные тесты должны рассматривать биологические реплики, а не тысячи клеток из одного образца как независимые единицы. Комплексная интеграция может привести к согласованию общей биологии, но она способна стереть реальные состояния. Маркерная аннотация усиливается с помощью картографирования ссылок, пространственных анализов цитометрии потока или экспериментов по возмущению.

Ключевые идеи

• Измеренный ноль может представлять биологическое отсутствие или неспособность захватить транскрипт.
• Диссоциация клеток, РНК и дублеты могут создавать систематические артефактов до начала секвенирования.
• Типы клеток выводятся из нескольких маркеров, экспериментального контекста и независимой проверки вместо одной кластерной метки.

Современные исследовательские границы

Граница сочетает в себе транскриптомы с доступностью хрмататина, поверхностные белки линейных штрих-кодов и пространственных координат на одной или сопоставленной клетке. Методы траектории и скорости РНК оценивают динамичность направления по данным моментального снимка в рамках допущений о кинетикой, выборке; они не наблюдают непосредственно линию. Большие атласы требуют иерархических моделей, которые сохраняют изменчивость и неопределенность доноров. Анализ конфиденциальности важен, потому что экспрессированные генетические варианты могут идентифицировать участников. Остающиеся проблемы включают абсолютную калибровку молекул, восстановление редких клеток и междисциплинарное исследование онтологии выравнивания с механистическими моделями . которые отличают регуляторный переход от коррелированных сдвигей в клеточном цикле или обработке тканей

Почему это важно

Технология отображает развитие, иммунитет и организацию тканей при клеточном разрешении. Он поддерживает атласы болезней, обнаружение целей и экспериментирование с изменениями клеточного состояния.

Пределы и открытыые вопросы

Обилие РНК — это только один слой клеточного состояния, и он не измеряет активность белка напрямую или его пространственное положение. Стоимость, предвзятость выборки и этические аспекты обработки донорской геномной информации ограничивают разработку исследования.